Этапы транскрипции и процессинга у эукариот. Процессинг, сплайсинг. Роль РНК в процессе реализации наследственной информации. Способ записи генетической информации

Процессинг рРНК: нарезание первичноготранскрипта, метилирование, сплайсинг. Уэукариот все рРНК синтезируются как часть одного транскрипта. Он нарезается с помощью экзо и эндонуклеаз на зрелыерРНК. Предшественник содержит 18, 5.8, 28S рРНК и называется 45S РНК. Процессинг рРНК требует участия мяРНК. У некоторых организмов в составе предшественника 28S РНК находятся вставки/интраны, кот.удаляются в результате процессинга и фрагменты РНК сшиваются в результате сплайсинга.

Упрокариот предшественник рРНК содержит 16, 23, 5S рРНК + несколько предшественников тРНК. 3 и 5’ концы сближены за счет комплиментарно прилегающих пар оснований. Такая структура разрезается РНКазойIII. Оставшиесярибонуклеотиды отрезаются экзонуклеазами/подравнивание. Процессинг 5’конца тРНК осуществляется РНКазой, а 3’конца – РНКазойД.тРНК-нуклеотидилтрансфераза достраивает ССА-хвост.

У эукариот предшественник тРНК содержит в себе интрон, он не ограничен консервативными последовательностями и встроен в антикодоновую петлю. Трекбуется удаление интронов и сплайсинг. В основе сплайсинга – узнавание вторичной структуры тРНК, требует участия ферментров с нуклеазной (расщипляют РНК на границкэкзон-интрон с двух сторон) и лигазной (сшивание свободных 3 и 5’-конов) активности. После высвобождения интронатРНК сворачивается в обычную структуру.

Процессинг мРНК. Модификация 5’-конца (кэпирование). Модификация 3’-конца (полиаденилирование). Сплайсинг первичных транскриптовмРНК, сплайсосома. Автосплайсинг. Альтернативный сплайсинг.

Процессинг пре-мРНК эукариот состоит из нескольких этапов:

1. Отрезание лишних длинных концевых последовательностей.

2. Присоединение к 5’-концу последовательности КЭПа, в котором обязательно присутствует 7-метилгуанозин, с которого начинается КЭП. Далее располагается 1-3 метилированныхрибонуклеотидов. Предполагают, что КЭП необходим для стабилизации мРНК, предохраняя ее от расщепления 5’-экзонуклеазами, а также узнается рибосомой. Образование КЭПа дает возможность прохождения сплайсинга.

3. Вырезание интронов и сплайсингэкзонов.

В сплайсинге, как правило, участвуют особые рибонуклеопротеиновые частицы (РНП) - малые ядерные РНП (мяРНП), в состав которых входят мяРНК, богатые урацилом и обозначаемые U1-U6 (иногда называемые рибозимами) и многочисленные белки. Эти РНП-частицы на стыках интронов и экзонов образуют функциональный комплекс, получивший название сплайсосомы (сплайсмосомы). Функции U-частиц заключаются в распознавании сайтов сплайсинга. В частности, UI узнает 5’-концевой сайт сплайсинга, a U2 - 3’-концевой сайт. При этом происходит комплементарное взаимодействие и сближение между этими сайтами и соответствующими последовательностями в РНК U1 и U2 частиц. Таким образом, происходит выпетливаниеинтрона. Соседние экзоны входят в контакт друг с другом в результате взаимодействия между факторами, распознающими индивидуальные экзоны.

Некоторые интроны удаляются с помощью автосплайсинга , не требуя никаких дополнительных компонентов, кроме самих пре-мРНК. Первым шагом является разрыв фосфодиэфирной связи в 5’-положении интрона, что приводит к отделению экзона 1 от молекулы РНК, содержащий интрон и экзон 2. 5’-конец интрона образует петлю и соединяется с нуклеотидом А, входящим в последовательность, называемую участком разветвления и расположенную выше 3’-конца интрона. В клетках млекопитающих участок разветвления содержит консервативную последовательность, ключевой А-нуклеотид в этой последовательности расположен в положении 18-28 пн выше 3’-конца интрона. У дрожжей этой последовательностью является UACUAAC. Интрон удаляется в форме лассо.

В некоторых случаях в аминокислотные последовательности трансформируются не все экзоны. В результате с одного гена считывается несколько мРНК - альтернативныйсплайсинг . Кроме того использование альтернативных промоторов и терминаторов может изменять 5’и 3’ концы транскрипта.

4. Добавление нуклеотидов к З’-концу последовательности из 150-200 адениловых нуклеотидов, осуществляемое специальными поли(А)-полимеразами.

5. Модификация оснований в транскрипте. Очень часто при созревании пре-мРНК происходят химические превращения некоторых оснований, например превращение одного азотистого основания в другое (С в U или наоборот).

Таким образом, в результате транскрипции образуются рибонуклеиновые кислоты. Таким образом, нуклеиновые кислоты обеспечивают поддержание жизнедеятельности клетки, путем хранения и экспрессии генетической информации, определяя биосинтез белка и получение организмом определенных признаков и функций.

В клетках бактерий к готовому, начинающему отделяться от матрицы участку мРНК присоединяются рибосомы и сразу же начинают синтез белка. Так образуется единый транскрипционно-трансляционный комплекс, который можно обнаружить с помощью электронного микроскопа.

Синтез РНК уэукариот проходит в ядре и отделен пространственно от места синтеза белка - цитоплазмы. У эукариот, вновь синтезированная РНК сразу же конденсируется с образованием множества рядом расположенных частиц, содержащих белок. В состав этих частиц входит РНК длиной приблизительно 5000 нуклеотидов, нить которой намотана на белковый остов, таким образом образуются гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиновые комплексы (гяРНП). Гетерогенны они потому, что имеют разные размеры. Часть этих комплексов являются сплайсмосомами и участвуют в удалении инронов и сплайсингеэкзоновпремРНК.

После процессинга зрелые молекулы мРНК эукариот узнаются рецепторными белками (входящими в состав ядерных пор), которые способствуют продвижению мРНК в цитоплазму. При этом основные белки, входящие в состав гяРНП никогда не покидают ядро и соскальзывают с мРНК по мере ее продвижения через ядерные поры.

В цитоплазме мРНК снова соединяется с белками, но уже цитоплазматическими, образуя мРНП. При этом обнаруживаются свободные мРНП-частицы (цитоплазматические информосомы), а также мРНП, связанные с полисомами (комплексами рибосом) (полисомные информосомы). Связанные с полисомамимРНК активно транслируются. Белки, связанные с информосомами, обеспечивают хранение в цитоплазме мРНК в нетранслируемом положении. Переход мРНК к полисомам сопровождается сменой белков - отщеплением или модификацией репрессорных белков и связыванием активаторных белков. Таким образом, в эукариотических клетках мРНК всегда находится в комплексе с белками, которые обеспечивают хранение, транспорт и регуляцию активности мРНК.

Синтез РНК (транскрипция РНК).

Структура РНК.

Организация генетического материала у эукариот.

Способ записи генетической информации

Организация генетического материала. Функциональные отделы генома.

Общие сведения об экспрессии генов.

1. Общие сведения об экспрессии генов

Как известно, в ДНК содержится определенная генетиче­ская информация:

О структуре всех белков и РНК организма, а также о порядке реализации этой информации в раз­ных клетках в процессе онтогенеза и при различных функциональных состояниях.

Поскольку во всех соматических клетках организма - один и тот же набор из 46 хромосом, - то, несмотря сильные отличия между клетками, все они содержат в своих ДНК одну и ту же генетическую информацию. (Некоторое исключение составляют лимфоциты, в процессе формирования которых происходит перестройка генов иммуноглобулинов.)

В процессе репликации ДНК генетиче­ская информация воспроизводится целиком, чтобы затем передаваться дочерним клеткам. Но, кроме того, эта информация экспрессируется (реализуется) в клетке, обуславливая все проявления ее жизнедеятель­ности. Однако экспрессии подвергается не вся имеющая­ся в ядре генетическая информация, а лишь какая-то ее часть.

Экспрессия информации о структуре определенного белка включает 2 основных этапа:

а) Первый из них - транскрипция: образование в клеточ­ном ядре на соответствующем гене (локализующемся в одной из хромосом) специального посредника - матричной РНК (мРНК).

Смысл этого процесса - переписывание информации о структуре белка с огромного неподвижного носителя (ДНК в составе хромосомы) на небольшой подвижный носитель -мРНК. Примерно так же обстоит дело, когда с же­сткого диска компьютера, содержащего тысячи фай­лов, переписывают один из них на дискету. Следовательно, мРНК, считанные с разных генов, должны отличаться друг от друга - как отли­чаются друг от друга сами гены. Другое важное обстоя­тельство: непосредствен­ный продукт транскрип­ции гена правильней называть предшественником мРНК (пре- мРНК). Дело в том, что новообразован­ная мРНК подвергается тут же (в ядре) созреванию, или процессингу. При этом она пре­терпевает существенную модификацию. И лишь после того зрелая мРНК поступает из ядра в цитоплазму.

б) Второй из основных этапов экспрессии гена трансля­ция: синтез белка на рибосомах по программе, диктуемой мРНК. Суть этой программы - определение очередности, в ко­торой аминокислоты должны включаться в строящуюся пеп­тидную цепь. Причем в процессе участвуют не свободные, а активированные аминокислоты: каждая из них связана с т. н. транспортной РНК (тРНК), т. е. находится в виде аминоацил- тРНК (аа- тРНК). Для каждой из 20 аминокислот имеется своя специфическая форма тРНК, а чаще даже не одна, а несколько форм.

Рибосомы же играют в трансляции роль молекулярных ма­шин, обеспечивающих правильное взаимодействие участников. В состав рибосомы входят четыре молекулы т. и. рибосомной РНК (рРНК) - по одной молекуле каждого из 4 х видов рРНК. Объединяясь с рибосомными белками, они образуют две субъе­диницы рибосомы и выполняют в них структурную, а также, возможно, каталитическую функции. Таким образом, в трансляции участвуют PНK трех клас­сов - мРНК, тРНК и рРНК.

2. Организация генетического материала. Функциональные отделы генома

Гены и их структура

Собственно информация о структуре белков и РНК записа­на в участках ДНК, называемых генами и цистронами.

Ген - это участок ДНК, кодирующий один белок.

Цистрон же участок ДНК, кодирующий одну полипептидную цепь.

У животных и чело­века цистроны нередко рас­полагаются в разных хромосомах и обычно тоже называ­ются генами. Кроме генов всех белков организма, в хромосомах имеются также гены РНК - четырех видов рибосомных РНК и нескольких десятков транспортных РНК.

Общая совокупность генов, определяющих наследственную информацию организма, называется геномом .

Почти все гены эукариот (в отличие от генов прокариот) имеют характерную особенность: содержат не только кодирую­щие участки -экзоны , но и некодирующие -интроны . Экзоны и интроны перемежаются друг с другом, что придает гену как бы «разорванную» структуру.

Число интронов в гене варьирует от 2 до несколь­ких десятков; в гене миози­на их около 50. Порой на ин­троны приходится до 90 % общей длины гена.

Прочие отделы ДНК

Между генами также находятся некодирующие последовательности - спейсеры . Несмотря на общее название, функциональная роль их может быть обсалютно различной.

а) Многие спейсерные участки, видимо, выполняют струк­турную роль:

Участвуют в правильной укладке нуклеосомной цепи в высшие структуры хроматина,

В прикреплении хромосом к аппарату центриолей и т. д.

б) Другие некодирующие участки ДНК служат специфиче­скими локусами связывания определенных белков:

Функционирующих на ДНК ферментов,

Белков, выполняющих регуляторную функцию.

При этом участки связывания РНК-полимеразы (фермента, синтезирующего РНК на ДНК) называются промоторами . Они либо вплотную примыкают к началу гена (или группы ге­нов), либо отделены от гена какими-либо другими функцио­нальными локусами.

в) У эукариот (включая человека) регуляцию «прочтения» ге­нов осуществляют не только белки-репрессоры, но и белки-ак­тиваторы - т. н. транскрипционные факторы.

К последним относятся уже упоминавшиеся общие факторы транскрипции, необходимые для связывания РНК полимеразы с промотором. Эти факторы имеются во всех клетках и необходи­мы для «прочтения» любого функционирующего гена.

Другие транскрипционные факторы повышают активность только определенных генов, и локусы ДНК, связывающие такие факторы, называются энхансерами .

г) Наконец, в ДНК могут содержаться короткие локусы, служащие сигналами об окончании (терминации ) транскрип­ции ДНК.

Терминирующие участки, распола­гающиеся после генов, называются терминаторами .

3. Способ записи генетической информации

Функциональная роль цепей ДНК

Две цепи ДНК в области гена принципиально различаются по своей функциональной роли: одна из них является кодирую­щей или смысловой , вторая - матричной .

Это значит, что в процессе «считывания» гена (транскрип­ции, или синтеза пре-мРНК) в качестве матрицы выступает только одна - матричная - цепь ДНК. Продукт же этого про­цесса - пре- мРНК по последовательности нуклеотидов сов­падает с кодирующей цепью ДНК (с заменой тиминовых основа­ний на урациловые).

Таким образом, получается, что с помощью матричной це­ни ДНК при транскрипции воспроизводится в структуре РНК генетическая информации кодирующей цепи ДНК.

На рисунках ген принято изображать так, чтобы кодирую­щая цепь была сверху; тогда, в соответствии с общим правилом изображения ДНК, 5"-конец кодирующей цепи дол­жен располагаться слева.

Информация на кодирующей цепи записана в направлении 5´→3´; следовательно, промотор находится со стороны 5"-конца кодирующей цепи гена. И этот же конец принято считать 5"-концом всего гена (хотя у его матричной цепи здесь находится 3‘- конец).

Основные свойства генетического кода

Единицей информации в кодирующей цепи ДНК является триплет - последовательность из трех нуклеотидов.

4 вида нуклеотидов (встречающиеся в ДНК) могут образо­вывать 64 вида триплетов. Из них 61 триплет является смы­словым, т. е. кодирует ту или иную из 20 аминокислот, а 3 три­плета являются «бессмысленными».

Как видим, на одну аминокислоту приходится в среднем несколько смысловых триплетов (в реальности от 1 до 6). По этой причине генетический код называют вырожденным . Не будь он таким, случайные точечные мутации (замены в ДНК одних нуклеотидов на другие) с очень высокой частотой приво­дили бы к появлению «бессмысленных» триплетов.

В то же время код специфичен : каждому из смысловых три­плетов соответствует только одна аминокислота.

Сама же информация о белке состоит в том, что в полном ге­не (исключая интроны) линейная последовательность триплетов кодирует аналогичную линейную последовательность аминоки­слот в первичной структуре данного белка (в направлении от аминного к карбоксильному концу пептидной цепи).

Этого оказывается вполне достаточно, поскольку первич­ная структура белка определяет пространственную конфигура­цию белковой молекулы, а также ее физико-химические и био­логические свойства.

Линейное соответствие между последовательностью три­плетов в экзонах гена и аминокислот в пептидной цепи обозначается как коллинеарность генетического кода.

Итак, генетический код является триплетным. специфиче­ским, вырожденным, коллинеарным и непрерывным. К этому списку обычно добавляют универсальность : у всех видов организмов смысл любого триплета один и тот же.

Генетический код

Говоря о коде, до сих пор мы имели в виду смысловую цепь ДНК. Но такова же, с учетом замены тимина (Т) на урацил (У), последовательность нуклеотидов в пре-мРНК.

Триплеты мРНК, соответствующие триплетам ДНК, назы­ваются кодонами . Действительно, именно они непосредственно:

Определяют порядок включения аминокислот в пептидную цепь, синтезируемую на рибосоме.

Кодоны одной аминокислоты различаются лишь последним (третьим) нуклеотидом.

У сходных по стро­ению аминокислот кодоны также сходны между собой: совпада­ют по двум нуклеотидам или по одному, но центрально­му, нуклеотиду.

4. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У ЭУКАРИОТ

Гены ряда белков и РНК

Одна из отличительных черт мно­гих генов эукариот - наличие в их составе некодирующих участков - интронов.

Другая особенность состоит в том, что наряду с уникальны­ми генами (представленными в гаплоидном геноме единичным числом копий) встречаются многократно повторяющиеся гены.

Чтобы проиллюстрировать эти две особенности, рассмо­трим некоторые конкретные гены:

Гены гистонов

Гистоны - основные (по кислотно-щелочным свой­ствам) белки, участвующие в формировании нуклеосомной структуры хроматина. Каждый из пяти видов эт­их белков (HI, Н2А, Н2В, НЗ и Н4) кодируется соответству­ющим геном.

Гены рибосомных РНК

В состав рибосом входят рРНК четырех видов. Данные РНК различаются по константе седиментации.

На функционирование генов оказывают влияние очень многие белки.

Общие факторы транскрипции

Общие факторы транскрипции – это такие транскрипционные факторы, которые необходимы для связывания РНК-полимера­зы с промотором, причем и сами тоже взаимодействуют с промотором.

Белок р53 как транскрипционный фактор

Среди большого числа уже открытых транскрипционных факторов наиболее известен, пожалуй, белок р53. Это объясня­ется тем, что он контролирует исключительно важные клеточ­ные процессы и, благодаря этому, вовлечен в большое количе­ство всевозможных регуляторных цепей.

Функциональная роль.

Белок р53 (или его ген) активируется в ответ на разнообраз­ные повреждения клеточной структуры:

Нерепарированные разрывы и другие повреждения ДНК,

Нарушение расхождения хромосом в митозе,

Разрушение микротрубочек и т. д.

В итоге через посредничество белка р53 клетка в ответ на повреждения своей структуры

Либо задерживается на той или иной стадии митотиче­ского цикла и исправляет эти повреждения;

Либо (при невозможности исправлений) вообще прекра­щает деления и вступает в процесс клеточного старения;

Либо (при потенциальной опасности поврежденной клет­ки для ее окружения) осуществляет апоптоз, т. е., по­просту говоря, самоубийство.

В частности, апоптозу, помимо прочих, подвергаются и клетки, в которых произошла опухолевая трансформация. В этой связи понятно, почему одновременно тормозится ангио­генез: это еще один способ ограничения опухолевого роста.

Поэтому белок р53 - один из наиболее важных опухоле­вых супрессоров. В большинстве же развивающихся опухолей функции белка р53 оказываются в том или ином отношении на­рушены.

5. СТРУКТУРА РНК

Все транскрипционные факторы, как и сама транскрипция, призваны обеспечить только одно - образование с нужной ско­ростью РНК на тех или иных участках хромосом.

Общий план строения РНК

Как и ДНК, РНК представляют собой линейные (т. е. неразветвленные) полинуклеотиды с тем же принципом организации:

Состоят из четырех видов нуклеотидов, каждое из которых включает азотистое основание, пентозу и фосфатный остаток;

Нуклеотиды связаны в цепь с помощью 5´,3´-фосфоди- эфирных связей;

Полинуклеотидные цепи полярны, т. е. имеют различи­мые 5"- и 3"-концы.

Но имеются и отличия от ДНК. Главное из них - то, что мо­лекулы РНК (кроме РНК некоторых вирусов) являются не двух-, а одноцепочечными. Причиной служат следующие три особен­ности первичной структуры.

а) Во-первых, пентоза в РНК это не дезоксирибоза, а ри боза, которая содержит дополнительную гидроксигруппу. По­следняя делает двухцепочечную структуру менее компактной.

б) Во вторых, среди четырех главных, или мажорных, азо­тистых основании вместо тимина содержится урацил, отличающнйся от тимина лишь отсутствием метильной группы в 5-м по­ложении.

6. СИНТЕЗ РНК (ТРАНСКРИПЦИЯ ДНК)

Общая характеристика транскрипции

В отличие от репликации ДНК, транскрипция ДНК происходит прак­тически во всех ядросодержащих клетках - как делящихся, так и неделящихся.

Причем в делящихся клетках она совершается в любой мо­мент митотического цикла, кроме периода репликации (у эука­риот) и собственно деления.

Более того, транскрипция какого либо участка ДНК может совершаться не только почти в любой момент цикла, но и много­кратно - сколь угодное число раз. С другой стороны, набор транскрибируемых в клетке участков под действием тех или иных факторов нередко меняется.

Ферментативное обеспечение процесса осуществляется РНК-полимеразой. У эукариот три вида этого фермента:

РНК-полимераза I - для синтеза пре-рРНК.

РНК-полимераза II - для синтеза пре-мРНК и

РНК-полимераза III - для синтеза пре-тРНК

Фермент ползет вдоль ДНК и катализирует поочередное включение в растущую цепь рибонуклеотидов, комплементар­ных нуклеотидам матричной цепи ДНК.

Еще одно сходство с синтезом ДНК состоит в направлении роста строящейся цепи - 5´→3´. Это значит, что у этой цепи оче­редные нуклеотиды присоединяются к З"-концу.

Как при всех матричных синтезах, строящаяся цепь антипараллельна матричной цепи ДНК. Следовательно, по­следняя транскрибируется ферментом в направлении 3´→5´.

Но имеются и принципиальные отличия от синтеза ДНК.

а) Асимметричность процесса: в качестве матрицы, как мы знаем, используется лишь одна цепь ДНК. Не совсем ясно, как ферментная система осуществляет правильный выбор нужной це­пи. Видимо, ключевую роль тут играют какие-то последователь­ности нуклеотидов на одной из цепей, узнаваемые системой.

б) Консервативность процесса: молекула ДНК по оконча­нии синтеза РНК возвращается в исходное состояние. При син­тезе же ДНК молекулы наполовину обновляются, что делает ре­пликацию полуконсервативной.

в) Наконец, синтез РНК не требует для своего начала ника­кой затравки, тогда как при репликации ДНК необходима РНК- затравка.

Механизм транскрипции

Инициация транскрипции

Первый и, пожалуй, важнейший этап транскрипции - это ее инициация: связывание РНК- полимеразы с промотором и образование первой межнуклеотидной связи.

О связывании РНК-полимеразы мы говорили уже не раз, поэтому сейчас лишь напомним основные моменты (с добавле­нием некоторых сведений).

У эукариот всегда требуется предварительное связывание с промотором целой совокупности белков общих факторов транскрипции, с образованием комплекса. Связавшись с промотором, РНК- полимераза вызывает ло­кальную денатурацию ДНК, т. е. разделение цепей ДНК на про­тяжении примерно 1,5 витка ДНК. Как говорят, образуется транскрипционный «гла­зок». Благодаря этому нуклеотиды матричной цепи ДНК в обла­сти «глазка» становятся доступными для спаривания с рНТФ (рибонуклеозидтрифосфат).

Первым в строящуюся цепь РНК всегда включается пури­новый нуклеотид - АТФ или ГТФ, причем все три его фосфат­ных остатка сохраняются.

Затем образуется первая 5",3"-фосфатная связь со вторым нуклеотидом.

Элонгация транскрипции

Следующий за инициацией этап - элонгация: постепенное удлинение растущей цепи пре- РНК до окончательного размера.

Это происходит по мере продвижения РНК-полимеразы по ДНК. Соответственно, перемещается и транскрипционный «глазок», т. е. участок локального расплетения ДНК. На транскрибированной же части ДНК двухцепочечная спи­ральная структура восстанавливается сразу после ухода РНК- полимеразы.

Примерная скорость движения фермента и синтеза РНК - 30 нуклеотидов в секунду.

Терминация транскрипции

Последний этап терминация, или окончание транскрип­ции.

Сигналом для этого служат специальные ГЦ-богатые участ­ки в конце генов. Поскольку сила взаимодействия пар ГЦ до­вольно велика, локальная денатурация таких участ­ков в ДНК происходит трудней. Это замедляет продвижение РНК -полимеразы и может служить для нее сигналом к прекра­щению транскрипции.

Но еще до окончания процесса в конце новосинтезированной РНК тоже успевает появиться ГЦ богатый участок. Благо­даря взаимодействию между своими нуклеотидами, он образует «шпильку».

Т. е. взаимодействия с нуклеотидами матричной цепи ДНК заменяются на «внутришпилечные» взаимодействия. Это облегчает отсоединение РНК от ДНК.

7. СОЗРЕВАНИЕ (ПРОЦЕССИНГ) РНК

Практически все процессы созревания РНК могут быть по­дразделены на три типа:

Удаление одних,

Присоединение других и

Модификация тех же или третьих нуклеотидов.

Удаление «лишних» последовательностей

Общее описание

Удаление «лишних» нуклеотидов осуществляется спе­циальными нуклеазами. Экзонуклеазы последовательно отще­пляют с определенного конца цепи (3´ или 5´) по одному нуклео­тиду. А эндонуклеазы разрезают цепь где-то в средних участ­ках, приводя к ее фрагментации.

Механизм, сплайсинга

Один из ключевых моментов рассматриваемого механизма обеспечение точности разрезания цепи пре-РНК: ошибка даже на один нуклеотид приведет к «сдвигу рамки», что изменит смысл всех кодонов мРНК или антикодона тРНК.

Точность достигается благодаря двум обстоятельствам:

Во-первых, в начале и в конце каждого интрона имеются определенные последовательности нуклеотидов: так, интроны всегда начинаются с Г-У, а кончаются дуплетом А-Г.

Во-вто­рых, для узнавания этих последовательностей используются специальные РНК т. н. малые ядерные РНК (мяРНК). По­следние связаны с ферментами, катализирующими сплайсинг. Такие рибонуклеопротеидные комплексы называются сплайосомами.

Сплайсинг начинается со взаимодействия двух мяРНК с на­чалом и концом интрона. Это дает «ориентацию» для эндону­клеазы: последняя действует на границах двух- и одноцепочеч­ных участков.

Первый разрыв пре-РНК происходит в области 5´ конца ин­трона - это место нахождения левого края левой мяРНК. При этом 5" конец интрона связывается с одним из ну­клеотидов в средней части того же интрона, что приводит к обра­зованию кольцевой структуры.

Присоединение и модификация нуклеотидов

Итак, в процессе созревания пре-РНК последняя теряет значительную часть нуклеотидов. Но происходит также и не­транскрипционное присоединение отдельных нуклеотидов.

В случае пре-мРНК со стороны 5"-конца присоединяется (с помощью нетипичной для полинуклеотидов пирофосфатной связи) 7-метилгуаниловый нуклеотид - компонент «колпач­ка». А со стороны З"-конца понуклеотидно наращивается поли(А)-фрагмент примерно из 200 нуклеотидов. Для этого ис­пользуются специальные ферменты; в частности, для образова­ния поли(А) - фрагмента полиаденилатполимераза.

В случае же пре-тРНК с З"-конца по очереди присоединяют­ся три нуклеотида - Ц, Ц и А, образующие акцепторную ветвь.

Кэпирование и полиаденилирование иРНК называется процессингом (посттранскрип-ционной модификацией).

Кэпирование:

К 5 " концу всех эукариотических иРНК присоединяется во время процессинга остаток 7-метилгуанозина с образованием уникальной 5 "à 5 " фосфодиэфирной связи . Этот дополнительный нуклеотид получил название кэп или колпачек.

Функции кэпа:

1. он защищает РНК от экзонуклеаз

2. помогает связыванию молекулы мРНК с рибосомой.

Полиаденилирование:

3"-конец также модифицируется сразу после завершения транскрипции. Специальный фермент – полиаденилат-полимераза присоединяет к 3"-концу каждого РНК-транскрипта от 20 до 250 остатков адениловой кислоты (поли(А)). Полиаденилатполимераза узнает специфическую последовательность AAУAAA, отщепляет от первичного транскрипта небольшой фрагмент в 11-30 нуклеотидов и затем присоединяет поли(А) последовательность. Принято считать, что такой "хвост" способствует последующему процессингу РНК и экспорту зрелых молекул мРНК из ядра.

По мере участия иРНК в процессах трансляции, длина полиА фрагмента уменьшается. Критическим для стабильности считается 30 адениловых нуклеотидов.

Вся совокупность ядерных транскриптов РНК-полимеразы II известна как гетерогенная ядерная РНК (гяРНК).

Все 3 класса РНК транскрибируются с генов, которые содержат интроны (неинформативные участки)и экзоны (участки ДНК, несущие информацию). Последовательности, кодируемые интронами ДНК, должны быть удалены из первичного транскрипта до того, как РНК станет биологически активной. Процесс удаления копий интронных последовательностей получил название сплайсинга РНК .

Сплайсинг РНК катализируется комплексами белков с РНК , известными как «малые ядерные рибонуклеопротеидные частицы» (мяРНП, англ. small nuclear ribonucleic particles, snRNP ).Такие каталитические РНК носят название рибозимов.

Функции интронов:

· защищают функционально активную часть генома клетки от повреждающего действия химических или физических (лучевых) факторов

· позволяет при помощи так называемого альтернативного сплайсинга увеличить генетическое разнообразие генома без увеличения числа генов.

Альтернативный сплайсинг:

В результате изменения распределение экзонов одного транскрипта во время сплайсинга возникают различные РНК и следовательно различные белки.

Известны уже более 40 генов, транскрипты которых подвергаются альтернативному сплайсингу. Например, транскрипт гена кальцитонина, в результате альтернативного сплайсинга дает РНК, которая служит матрицей для синтеза кальцитонина (в щитовидной железе) или специфического белка, отвечающего за вкусовое восприятие (в мозге). Еще более сложному альтернативному сплайсингу подвергается транскрипт гена -тропомиозина. Были идентифицированы по крайней мере 8 различных тропомиозиновых иРНК, полученных из одного транскрипта (см рис)

33 . Общая схема биосинтеза белка - необходимые предпосылки:

Информационный поток - схема передачи информации (центральная догма молекулярной биологии). Репликация и транскрипция ДНК - ферменты, механизм. Обратная транскрипция, роль ревертаз. Процессинг и сплайсинг иРНК. Характеристика генетического кода, кодон, антикодон.

Отличие биосинтеза белка от биосинтеза других молекул:

· Нет соответствия между числом мономеров матрицы и в продукте реакции (4 нуклеотида--20 аминокислот)

· Между мРНК (матрица) и пептидной цепью белка (продукт) нет комплементарности.

Общая схема биосинтеза белка - необходимые предпосылки:

· информационный поток (передача информации от ДНК на РНК и на белок)

· пластический поток (аминокислоты, мРНК, тРНК, ферменты)

· энергетический поток (макроэрги АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ)

Процессинг - это этап формирования функционально активных молекул РНК из первоначальных транскриптов. Процессинг рассматривают как посттранскрипционные модификации РНК, характерные для эукариот. (У прокариот процессы транскрипции и трансляции иРНК идут почти одновременно. Этот тип РНК у них процессинга не претерпевает.)

В результате процессинга первичные транскрипты РНК превращаются в зрелые РНК. Поскольку существует несколько различных типов РНК, то для каждого из них характерны свои модификации.

Процессинг информационной (матричной) РНК

На участках ДНК, кодирующих структуру белка, образуется предшественник информационной (матричной) РНК (пре-иРНК). Пре-иРНК копирует всю нуклеотидную последовательность ДНК от промотора до терминатора транскриптона. То есть она включает концевые нетранслируемые области (5" и 3"), интроны и экзоны.

Процессинг пре-иРНК включает в себя кэпирование, полиаде ни лирование, сплайсинг , а также некоторые другие процессы (метилирование, редактирование).

Кэпирование - это присоединение 7-метил-ГТФ (7-метилгуанозинтрифосфат) к 5"-концу РНК, а также метилирование рибозы двух первых нуклеотидов.

В результате образуется так называемая «шапка» (кэп). Функция кэпа связана с инициацией трансляции. Благодаря ему начальный участок иРНК прикрепляется к рибосоме. Также кэп защищает транскрипт от разрушительного действия рибонуклеаз и выполняют ряд функций в сплайсинге.

В результате полиаде ни лирования к 3"-концу РНК присоединяется полиадениловый участок (поли-А) длинной примерно 100-200 нуклеотидов (содержащих аденин). Данные реакции обеспечивает фермент поли-А-полимераза. Сигналом к полиаденилированию служит последовательность AAUAAACA на 3"-конце. В месте -CA происходит разрезание молекулы иРНК.

Поли-А защищает молекулу РНК от ферментативного распада.

Кэпирование и полиаденилирование происходят еще на этапе транскрипции. Кэп образуется сразу после высвобождения из РНК-полимеразы 5"-конца синтезируемой РНК, а поли-А образуется сразу после терминации транскрипции.

Сплайсинг представляет собой вырезание интронов и соединение экзонов. Экзоны могут соединяться по-разному. Таким образом из одного транскрипта могут образовываться разные иРНК. В сплайсинге информационной РНК участвуют малые ядерные РНК, которые имеют участки, комплементарные концам интронов и связываются с ними. Кроме мяРНК в сплайсинге участвуют различные белки. Все вместе (белки и мяРНК) формируют нуклеопротеидный комплекс - сплайсосому .

После процессинга иРНК становится короче своего предшественника иногда в десятки раз.

Процессинг других видов РНК

При процессинге молекул рибосомальных и транспортных РНК не происходит кэпирования и полиаденилирования. Модификации данных видов РНК происходят не только у эукариот, но и у прокариот.

Три вида рибосомальной РНК эукариот образуются в результате расщепления одного транскрипта (45S-РНК).

Процессинг ряда транспортных РНК может также включать расщепление одного транскрипта, другие тРНК получаются без расщепления. Особенностью процессинга тРНК является то, что молекула РНК проходит длинную цепь модификаций нуклеотидов: метилирование, дезаминирование и др.

Сразу после синтеза первичные транскрипты РНК по разным причинам еще не имеют активности, являются "незрелыми" и в дальнейшем претерпевают ряд изменений, которые называются процессинг . У эукариот процессингу подвергаются все виды пре-РНК, у прокариот – только предшественники рРНК и тРНК.

Процессинг предшественника матричной РНК

При транскрипции участков ДНК, несущих информацию о белках, образуются гетерогенные ядерные РНК, по размеру намного превосходящие мРНК. Дело в том, что из-за мозаичной структуры генов эти гетерогенные РНК включают в себя информативные (экзоны ) и неинформативные (интроны ) участки.

1. Сплайсинг (англ. splice – склеивать встык) – особый процесс, в котором при участии малых ядерных РНК происходит удаление интронов и сохранение экзонов.

Последовательность событий сплайсинга

2. Кэпирование (англ. cap – шапка) – происходит еще во время транскрипции. Процесс состоит в присоединении к 5"-трифосфату концевого нуклеотида пре-мРНК 5"-углерода N 7 -метил-гуанозина.

"Кэп" необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 5"-конца, а также для связывания мРНК с рибосомой и для начала трансляции.

3. Полиаденилирование – при помощи полиаденилат-полимеразы с использованием молекул АТФ происходит присоединение к 3"-концу РНК от 100 до 200 адениловых нуклеотидов, формирующих полиадениловый фрагмент – поли(А)-хвост. Поли(А)-хвост необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 3"-конца.

Схематичное представление матричной РНК после процессинга

Процессинг предшественника рибосомальной РНК

Предшественники рРНК являются более крупными молекулами по сравнению со зрелыми рРНК. Их созревание сводится к разрезанию прерибосомной РНК на более мелкие формы, которые уже непосредственно участвуют в формировании рибосомы. У эукариот существуют четыре типа рРНК – 5S-, 5,8S-, 18S- и 28S-рРНК . При этом 5S-рРНК синтезируется отдельно, а большая прерибосомная 45S-РНК расщепляется специфичными нуклеазами с образованием 5,8S-рРНК, 18S-рРНК и 28S-рРНК.

У прокариот молекулы рибосомальной РНК совсем иные по своим свойствам (5S-, 16S-, 23S-рРНК), что является основой изобретения и использования ряда антибиотиков в медицине.

Процессинг предшественника транспортной РНК

1. Модификация нуклеотидов в молекуле путем дезаминирования, метилирования, восстановления.
Например, образование псевдоуридина и дигидроуридина.

Строение модифицированных уридиловых нуклеотидов

2. Формирование антикодоновой петли происходит путем сплайсинга